<!DOCTYPE html><html lang="en" data-theme="light"><head><meta charset="UTF-8"><meta http-equiv="X-UA-Compatible" content="IE=edge"><meta name="viewport" content="width=device-width, initial-scale=1.0,viewport-fit=cover"><title>蛋白组学结果分析 | 杜鑫辉医生的博客空间</title><meta name="author" content="杜鑫辉"><meta name="copyright" content="杜鑫辉"><meta name="format-detection" content="telephone=no"><meta name="theme-color" content="#ffffff"><meta name="description" content="蛋白组学结果解读1.蛋白质组数据分析，数据库如何选择？ 答：a) 常见的公共库有Uniprot、NCBI、和Ensembl。一般来说模式物种如人、小鼠、斑马鱼等，可以选择蛋白注释信息较为全面的Swissprot；大鼠使用Ensembl数据库；其他常见物种推荐用Uniprot，如果不是常见物种，可以选择数据库量较大的NCBI公共库。 b) 对于在Uniprot上数据库注释蛋白条目不多的物种，可以根据">
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<p>答：<br>a) 常见的公共库有Uniprot、NCBI、和Ensembl。一般来说模式物种如人、小鼠、斑马鱼等，可以选择蛋白注释信息较为全面的Swissprot；大鼠使用Ensembl数据库；其他常见物种推荐用Uniprot，如果不是常见物种，可以选择数据库量较大的NCBI公共库。</p>
<p>b) 对于在Uniprot上数据库注释蛋白条目不多的物种，可以根据物种的科属种适当放大，以获得更多的蛋白组信息。</p>
<p>c) 需提前提供样本物种的拉丁文名，我们在数据库中搜索对应物种的拉丁名称。如果蛋白条目数目或查库结果仍不能满足需求，可再适当放大。</p>
<p>d) 对于数据库注释信息少，或非常见物种的，也可以选择用转录组数据库翻译后的蛋白库对质谱结果进行查库注释。</p>
<p>2.为什么蛋白搜库结果用NCBI 比用Uniprot要较多一些？为什么一些在NCBI中搜到的在Uniprot里面搜不到？</p>
<p>答： NCBI中蛋白库的信息任何一个研究者都能提交，因此NCBI中搜录的蛋白质信息较丰富，但是很多蛋白的信息是没有经过验证或人工校验就直接提交到NCBI蛋白库中的，会有很多冗余的蛋白信息（例如，同一个蛋白会因为不同的人提交而具有不同的登录号及很多重复的相关的信息）；Uniprot中的蛋白信息远没有NCBI中蛋白库的信息多，但Uniprot中的蛋白信息大多数都是经过验证或人工校验的。两个数据库都是可用的，具体还是需要看物种；如果本身是模式物种，那么选择未注释信息较多的NCBI数据库就没有那么必要了；而相对于研究较少的或比较冷门的物种，这类物种的蛋白已知注释信息本身就很少，那么选择NCBI数据库则可以相应地提高蛋白的鉴定数量。</p>
<p>3.做IP时，出现了很多的内参蛋白（如Actin&#x2F;Tubulin等），这是什么原因？</p>
<p>答： 内参蛋白在组织和细胞中的含量相对较高，是很容易非特异性结合到磁珠上的，只有它们在实验组中明显比对照组中多很多的情况下才认为它是可能的互作蛋白。</p>
<p>4.什么是KEGG数据库？</p>
<p>答： KEGG全称是Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，对生物学高级功能和生物系统（如细胞、生物和生态系统）进行了注释，从分子水平信息，尤其是大型分子数据集生成的基因组测序和其他高通量实验技术的实用程序数据库资源，由日本京都大学生物信息学中心的Kanehisa实验室于1995年建立，是国际最常用的生物信息数据库之一，以“理解生物系统的高级功能和实用程序资源库”著称。</p>
<p>网址链接：<a target="_blank" rel="noopener" href="https://www.kegg.jp/kegg/">https://www.kegg.jp/kegg/</a></p>
<p>5.为什么KEGG通路结果中出现太多与本物种无关的通路信息？</p>
<p>答： 很多蛋白不仅仅是在某特定物种中存在的，KEGG网站上收录的蛋白通路信息虽然可以设置物种，但是非物种特异性的蛋白还是会涉及其他通路，这部分不符合研究背景的KEGG通路可以后期人为的剔除再去重新做富集分析即可。</p>
<p>6.蛋白质查库软件有哪些？</p>
<p>答： 常见的蛋白质查库软件有：Mascot，Maxquant，Proteome Discoverer</p>
<p>a)普通的蛋白质定性分析可以根据需求选择查库软件，Mascot一般筛选标准较为宽松，想要尽可能多的获得蛋白质定性信息进行初步的筛选，可以选择用Mascot进行搜库。</p>
<p>b)普通的标记定量蛋白质组学一般使用Proteome Discoverer；修饰蛋白质组学和非标蛋白质组学可以选用Maxquant或者Proteome Discoverer。</p>
<p>7.什么是质谱结果中的母离子和子离子？</p>
<p>答： 以蛋白样本为例，通常采用的分析步骤是将蛋白酶解为肽段，再用质谱对肽段进行上机分析，这些肽段在进入质量分析器之前会被带上电荷，因为质谱只能检测带电荷的物质，这些带电荷的肽段在一级质谱中被检测时，就是母离子。如果要进一步确证序列，就会把肽段碎裂成更短的序列，这些更短的序列进一步被第二个质量分析器检测，即子离子。</p>
<ol start="8">
<li>什么是PRM技术？</li>
</ol>
<p>PRM（平行反应监测，Parallel Reaction Monitoring），是目前靶向蛋白质组学数据采集的主流方法，通过对特异性肽段或目标肽段（如发生翻译后修饰的肽段）进行选择性检测，从而实现对目标蛋白质&#x2F;修饰肽段的靶向相对或绝对定量。<br>PRM技术原理平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring,PRM) 是一种基于高分辨、高精度质谱的离子监视技术，能够对目标蛋白质、目标肽段（如发生翻译后修饰的肽段）进行选择性检测，从而实现对目标蛋白质&#x2F;肽段的定量。首先利用四级杆质量分析器的选择检测能力，在一级质谱中选择性地检测目标肽段的母离子信息。随后，在collision cell中对母离子进行碎裂；最后利用高分辨、高质量精度分析器在二级质谱中检测所选择的母离子窗口内的所有碎片的信息。这样即可对复杂样本中的目标蛋白质&#x2F;肽段进行准确地特异性分析。而“鸟枪法”（Shot-gun）与PRM是两种不同的质谱扫描方式。“鸟枪法”的目标是尽可能多的检测样品中的蛋白，易于检测到丰度较高蛋白，而PRM则是针对特定蛋白实现精准定量。</p>
<p>9.目标蛋白定量用PRM代替WB的优势</p>
<p>PRM常被称为“质谱领域的WB”。WB是依赖于抗体的检测方法，其效果与抗体的质量、实验操作密切相关，而且严格说来，其基于显色条带亮度的定量只能说是“半定量”。目前市场上抗体质量参差不齐，很多蛋白又没有商品化抗体可以购买，制备单抗周期又长，这些因素很大程度上限制了WB的效果。PRM则是一种不依赖抗体，基于质谱的靶向定量技术，所以对一些没有抗体的蛋白，以及针对翻译后修饰的蛋白，通过PRM可以很快拿到定量结果。PRM灵敏度高，特异性好，定量范围可达4个数量级以上，实现了真正意义上的蛋白精确定量。另外，通量方面，一次PRM实验可同时对多达几十个蛋白进行同时定量，这也是WB很难达到的。</p>
<p>10.为什么通过Elisa或Western Blot能够检测到的蛋白在质谱中并没有检测到？</p>
<p>答： 一般复杂样本中蛋白种类非常多，质谱检测并不能将所有蛋白质全部鉴定到，有些丰度含量较低的蛋白在质谱结果中不一定能够完整体现；Elisa&#x2F;WB相比与质谱来说灵敏度不同，前者具有放大效应，抗体会对目标蛋白有一个富集效应，所以只要选对抗体，感兴趣的蛋白基本都会被检测到；而质谱结果中，如果目标蛋白丰度较低，在组学中未检测到也是正常的，质谱检测的后期验证建议用PRM。</p>
<p>11.有时候检测后做WB验证，发现趋势相反，有哪些原因呢？</p>
<p>答： 有一些是和蛋白的修饰状态有关。例如某种生理&#x2F;病理现象并不和蛋白分子的表达值高低存在关联，而是修饰后的表达有关。另外在信号通路里，可能存在于信号上游，没有抓取到。另外还需要看下蛋白对应的肽段质量情况，肽段质量不高的话，也有可能是定量不准确造成的。</p>
<p>12.经验证目标蛋白质存在特定修饰，为什么质谱鉴定未检测到该修饰？</p>
<p>答： 修饰蛋白质一般属于低丰度的蛋白质，有可能未被检测到；该修饰位点所在片段酶切后产生的肽段可能过小或者过大，不利于质谱检测；这种情况可以更换不同的酶进行酶切，可预先根据酶切位点进行序列分析；如果质谱检测到该位点所在的肽段，但却未检测到修饰，可能是因为该位点修饰水平太低，不利于被检测到。这种情况可以通过其他方法提高目标蛋白质的含量尤其是发生修饰的蛋白质的含量，进一步对修饰肽段进行富集，才有希望通过质谱检测到。</p>
<p>13.什么是Motif分析？</p>
<p>答： Motif Analysis（基序分析）就是指对蛋白质结构进行分析，可找出新发现的蛋白质可能具有的结构域，并由此推测其功能。一般用于修饰蛋白质组学；用来预测修饰位点。</p>
<p>14.为什么我的蛋白鉴定结果偏少？</p>
<p>答：</p>
<p>a) 样本本身的蛋白量较少，如果SDS-PAGE结果显示条带比较少且很淡，则是样本本身的原因导致的；</p>
<p>b) 数据库不完整，如石斑鱼来源样品，这种情况下通常会将数据库向上推2-3个级别，查询更大的数据库。同时不常见物种可能数据库信息很少，需要搜近缘物种的库，这种也会导致蛋白质鉴定结果偏少；</p>
<p>c) 样品中含有高丰度蛋白未去除，也会影响质谱鉴定结果。</p>
<p>15.查库参数中设置最大允许漏切的数目2是什么意思呢？</p>
<p>答： 蛋白经胰酶酶切后，可能有些酶切位点并没有被切开。分析时一般采用最大2个漏切位点。</p>
<p>16.肽段A和肽段B中如果只是相差几个氨基酸，都是对应同一个蛋白，这种情况是不是酶解不充分？</p>
<p>答： 蛋白质酶解过程中，可能因为理论酶切位点发生修饰等情况，导致蛋白酶漏切的情况出现。因此，为了保证存在漏切位点的肽段在数据库检索过程中也能匹配到，检索参数会设置最大漏切位点数为2（报告参数中体现为miss cleavage 2）。所以在肽段列表中会出现两种肽段序列相似，某一种肽段存在K或者R的漏切位点的情况。这种情况属于质谱检测的正常现象。</p>
<p>17.可不可以将之前的蛋白组结果和这次的蛋白组放在一起分析？能不能使用公共数据库里的蛋白组数据和我的蛋白组结果一起分析？</p>
<p>答： 两次实验条件如果不一致，例如使用的技术、仪器、参数不同，得到的数据不建议放在一起分析。</p>
<p><strong>18.在蛋白质定量数据表中，Unique Peptide是不是越多越好，Peptide&#x3D;1的蛋白质定量结果是否不太准确，最好将其排除？</strong></p>
<p>答： 首先Unique Peptide在不同情况下有两种不同的含义：一种情况指用于定性的Unique Peptide；第二种情况则是指用于定量的Unique Peptide。简单来说，肯定是检测到的蛋白质的（定性）Unique Peptide越多，蛋白质可信度越高。随着现在质谱仪精度和分辨率的提高，对应高精度质谱仪产生的数据，像MCP或者JPR这类蛋白质组学领域最好的杂志，也明确表示认可Unique Peptide&#x3D;1且对应图FDR谱质量较高的数据，只是根据杂志的不同要求需要提交不同格式的图谱数据。另一方面，对于定量Unique Peptide的数量，文章一般都没有要求。对于只有一段肽定量一个蛋白质的情况，蛋白质定量结果的准确性和可靠性会相对较低。在实验中，都可以通过设置生物学重复来消除这部分影响。</p>
<p><strong>19.蛋白组原始数据提交用什么网站？需要提交什么数据类型？</strong></p>
<p>答： 目前，投稿主流的蛋白质组学杂志时，要求或者推荐采用该平台上传发表文章的质谱数据。PX Submission tool（下载地址：<a target="_blank" rel="noopener" href="http://www.proteomexchange.org/submission%EF%BC%89%E3%80%82%E9%9C%80%E8%A6%81%E6%8F%90%E4%BE%9B%E7%9A%84%E5%8E%9F%E5%A7%8B%E6%95%B0%E6%8D%AE%E6%9C%89%EF%BC%9ARaw%E6%96%87%E4%BB%B6%EF%BC%88%E5%8E%9F%E5%A7%8B%E8%B4%A8%E8%B0%B1%E6%96%87%E4%BB%B6%EF%BC%89%EF%BC%9Bmsf%E6%96%87%E4%BB%B6%EF%BC%88%E6%9F%A5%E5%BA%93%E7%BB%93%E6%9E%9C%E5%8E%9F%E5%A7%8B%E6%96%87%E4%BB%B6%EF%BC%89%EF%BC%9BProt.xml%E6%96%87%E4%BB%B6%EF%BC%88%E8%9B%8B%E7%99%BD%E6%9F%A5%E5%BA%93%E7%BB%93%E6%9E%9C%EF%BC%89%EF%BC%9BPep.xml%E6%96%87%E4%BB%B6%EF%BC%88%E8%82%BD%E6%AE%B5%E6%9F%A5%E5%BA%93%E7%BB%93%E6%9E%9C%EF%BC%89%EF%BC%9BDatabase">http://www.proteomexchange.org/submission）。需要提供的原始数据有：Raw文件（原始质谱文件）；msf文件（查库结果原始文件）；Prot.xml文件（蛋白查库结果）；Pep.xml文件（肽段查库结果）；Database</a> 文件（查库所用数据库）；mgf（即peaklist文件，非必要）。</p>
<p><strong>20.如何在KEGG通路图中查找目标蛋白？</strong></p>
<p>答： 在蛋白质组学研究中，查库数据库通常采用UniProt、NCBI等数据库的信息，这部分数据库有可能存在与KEGG显示名称不一致的情况，因此在通路图中快速定位感兴趣的目标蛋白可能具有一定的困难。一般我们在NCBI数据库中找到对应蛋白的GENE名称或者蛋白名称在KEGG对应条目中去搜索。</p>
<p><strong>21.如何对差异蛋白进行相互作用分析？</strong></p>
<p>答： String数据库是一个搜索已知蛋白质之间和预测蛋白质之间相互作用的数据库，该数据库可应用于14094个物种，包含6760万种蛋白质和200亿种蛋白质之间的相互作用。它除了包含有实验数据、从PubMed摘要中文本挖掘的结果和综合其他数据库数据外，还有利用生物信息学的方法预测的结果。</p>
<p>目前String数据库覆盖的物种较多，相互作用信息收录较多，网址如下：<a target="_blank" rel="noopener" href="https://string-db.org/">https://string-db.org/</a></p>
<p><strong>22.怎么判断酶解是否充分？</strong></p>
<p>答： 绝大部分质谱鉴定到的蛋白所对应的肽段长度分布在 8-35 个氨基酸残基之间，说明样本制备达到标准，胰蛋白酶实现充分酶切。如果有较多长链肽段，可能是由于没有充分酶切导致的。</p>
<p><strong>23.从哪里可以看到我做的蛋白组检测搜的库是什么？</strong></p>
<p>答： 分析报告中会列出本次使用数据库。例如：Uniprot_Human_20394_202004，数据库+物种+序列数+版本号。</p>
</article><div class="post-copyright"><div class="post-copyright__author"><span class="post-copyright-meta">Author: </span><span class="post-copyright-info"><a href="https://gitee.com/drduxinhui">杜鑫辉</a></span></div><div class="post-copyright__type"><span class="post-copyright-meta">Link: </span><span class="post-copyright-info"><a href="https://gitee.com/drduxinhui/2023/10/05/%E8%9B%8B%E7%99%BD%E7%BB%84%E5%AD%A6%E7%BB%93%E6%9E%9C%E5%88%86%E6%9E%90/">https://gitee.com/drduxinhui/2023/10/05/%E8%9B%8B%E7%99%BD%E7%BB%84%E5%AD%A6%E7%BB%93%E6%9E%9C%E5%88%86%E6%9E%90/</a></span></div><div class="post-copyright__notice"><span class="post-copyright-meta">Copyright Notice: </span><span class="post-copyright-info">All articles in this blog are licensed under <a target="_blank" rel="noopener" href="https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/">CC BY-NC-SA 4.0</a> unless stating additionally.</span></div></div><div class="tag_share"><div class="post-meta__tag-list"></div><div 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  const $mermaid = document.querySelectorAll('#article-container .mermaid-wrap')
  if ($mermaid.length === 0) return
  const runMermaid = () => {
    window.loadMermaid = true
    const theme = document.documentElement.getAttribute('data-theme') === 'dark' ? 'dark' : 'default'

    Array.from($mermaid).forEach((item, index) => {
      const mermaidSrc = item.firstElementChild
      const mermaidThemeConfig = '%%{init:{ \'theme\':\'' + theme + '\'}}%%\n'
      const mermaidID = 'mermaid-' + index
      const mermaidDefinition = mermaidThemeConfig + mermaidSrc.textContent

      const renderFn = mermaid.render(mermaidID, mermaidDefinition)

      const renderV10 = () => {
        renderFn.then(({svg}) => {
          mermaidSrc.insertAdjacentHTML('afterend', svg)
        })
      }

      const renderV9 = svg => {
        mermaidSrc.insertAdjacentHTML('afterend', svg)
      }

      typeof renderFn === 'string' ? renderV9(renderFn) : renderV10()
    })
  }

  const loadMermaid = () => {
    window.loadMermaid ? runMermaid() : getScript('https://cdn.jsdelivr.net/npm/mermaid/dist/mermaid.min.js').then(runMermaid)
  }

  btf.addModeChange('mermaid', runMermaid)

  window.pjax ? loadMermaid() : document.addEventListener('DOMContentLoaded', loadMermaid)
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